VP 1 – Molekulární biologie a genomika

Výzkumný program je tvořen 8 hlavními aktivitami

Hlavní aktivita 1 Identifikace a charakterizace nových nebo málo studovaných virů

V návaznosti na již započatý výzkum budou studovány viry vybraných protistních skupin, především trypanosomatidů a jednobuněčných řas, s cílem ozřejmit jejich diverzitu, evoluci a interakci s hostitelem. Očekáváme objev zcela nových virů prostřednictvím analýz genomových dat. Budou rovněž analyzována metagenomická data s cílem zmapovat skutečnou diverzitu vybraných skupin virů a jejich genový repertoár, se zvláštním zřetelem ke skupinám PLV a NCLDV virů.

Aktivita bude realizována v dílčích etapách s definovanými cíli, očekávanými pravděpodobnými výstupy, přínosy a poznatky:

• Bioinformatická analýza diverzity RNA virů trypanosomatidů a jednobuněčných řas v transkriptomických databázích
  • Generování nových transkriptomických dat z kultur trypanosomatidů a jednobuněčných řas
  • Systematický průzkum transkriptomických databází trypanosomatidů a jednobuněčných řas cílený na identifikaci přítomnosti genů charakteristických pro RNA viry (RNA-dependentní, RNA polymeráza)
  • Detailní srovnávací a fylogenetické analýzy nalezených kandidátních virových sekvencí
  
  
• Detailní srovnávací a fylogenetické analýzy nalezených kandidátních virových sekvencí
  • Generování nových genomických dat z kultur trypanosomatidů a jednobuněčných řas
  • Systematický průzkum sekvenčních databází trypanosomatidů a jednobuněčných řas cílený na identifikaci genů charakteristických pro cílové skupiny virů (kapsidové proteiny, DNA polymerázy atd.)
  • Detailní srovnávací a fylogenetické analýzy nalezených kandidátních virových sekvencí
  
  
• Cílené vyhledávání vybraných skupin virů v metagenomech a metatranskriptomech
• Cílené in vitro a in vivo studie nově objevených virů

Hlavní aktivita 2 Identifikace a charakterizace virulenčních faktorů leishmánií

Bude pokračovat velmi dobře běžící výzkumný program směřující k pochopení molekulárních determinant virulence lidských patogenů rodu Leishmania, především s využitím modelového druhu L. mexicana. Budou testovány další kandidáti pro virulenční faktory pomocí širokého arzenálu in vitro i in vivo metod funkční genomiky. Součásti této výzkumné linie bude i další studium fyziologické funkce enzymu katalázy u trypanosomatidů s cílem pochopit, jakou roli hrála ztráta tohoto enzymu v evoluci dixenického životního cyklu leishmanií.

Aktivita bude realizována v dílčích etapách s definovanými cíli, očekávanými pravděpodobnými výstupy, přínosy a poznatky:

• Bioinformatická analýza potenciálních faktorů virulence leishmánií
  • Výběr potenciálních faktorů virulence leishmánií z odborné literatury a vlastních databází
  • Analýza úrovně exprese vybraných genů s pomocí databáze TriTrypDB
  
  
• Testování účinků potenciálních antiparazitik na fyziologii leishmánií
  • Hodnocení účinku sloučeniny callunenu na in vitro kultury procyklických promastigotů and amastigotů L. mexicana
  • Hodnocení účinku sloučeniny callunenu na propagaci L. mexicana in vivo v hmyzích vektorech a myších hostitelích
  • Obdobné testy dalšího (v průběhu výzkumu definovaného) kandidátního antiparazitika
  
  
• Funkční analýza potentciálních faktorů virulence leishmánií
  • Podrobná fenotypická charakterizace knock-outových linií
  • In vitro charakterizace produktů cílových genů
  • In vivo charakterizace produktů cílových genů
  
  
• Studium fyziologické funkce enzymu katalázy u trypanosomatidů
  • In vitro charakterizace produktů cílových genů
  • Srovnávací analýzy biochemických charakteristik kataláz trypanosomatidů: lokalizace, úroveň exprese a stabilita
  • Analýza rolí katalázy u monoxenických trypanosomatidů rodu Leptomonas: knock-out a tagging katalázy v Leptomonas seymouri
  
  
• Publikování výsledků

Hlavní aktivita 3 Komplexní výzkum endosymbiontů protistů

Pomocí genomických a dalších metod bude studována biologie prokaryotických endosymbiontů vybraných skupin protistů především trypanosomatidů a jednobuněčných řas. V případě kinetoplastidů půjde zejména o systémy „Novymonas esmeraldas – Ca. Pandoraea novymonadis“ a „Angomonas deanei – Ca. Kinetoplatobacterium sp.“ Tento výzkum by měl zejména odhalit molekulární mechanismy na pozadí příslušných endosymbiotických vztahů.

Aktivita bude realizována v dílčích etapách s definovanými cíli, očekávanými pravděpodobnými výstupy, přínosy a poznatky:

• Výběr perspektivních modelových systémů "hostitel-endosymbiont"
  • Průzkum historické literatury o protistech s potenciálními endosymbionty
  • Systematický screening genomických a transkriptomických dat
  
  
• Základní charakterizace hostitelů a jejich endosymbiontů

Taxonomická a fylogenetická charakterizace

Morfologická a ultrastrukturní charakterizace

• Genomická charakterizace hostitelů a jejich endosymbiontů
  • Generování a assembly genomických a transkriptomických dat
  • Bioinformatické analýzy genomických a transkriptomických dat
  
  
• Funkční charakterizace vztahů "endosymbiont-hostitel"
  • Fyziologické, biochemické a proteomické analýzy
  • Cílené genetické manipulace
  
  
• Publikování výsledků

Hlavní aktivita 4 Etablování možností cílených genetických manipulací u vybraných protistních modelů

Zavedením technik cílených genetických manipulací, především na bázi CRISPR-Cas systému, budou zásadně rozšířeny možnosti funkčně genomického výzkumu u vybraných významných modelových jednobuněčných eukaryot. V prvé řad půjde o některé zástupce trypanosomatidů, např. Vickermania ingenoplastis nebo Novymonas esmeraldas, vyznačující se unikárními biologickými vlastnostmi odhalenými dosavadními genomickými a transkriptomickými analýzami. V rámci tohoto výzkumného směru bude rovněž dále studován unikátní translační systém trypanosomatidů rodu Blasthocrithidia s pozičně závislým významem některých kodonů.

Aktivita bude realizována v dílčích etapách s definovanými cíli, očekávanými pravděpodobnými výstupy, přínosy a poznatky:

• Optimalizace kultivačních a selekčních podmínek
  • Testování optimálních podmínek pro kultivaci cílových organismů
  • Testování vhodných strategií a agens pro selekci geneticky modifikovaných linií
  
  
• Vývoj protokolů pro přípravu cílených knock-in mutantů
  • Testování alternativních variant použití technologie CRISPR-Cas9 u nových experimentálních modelů
  • Selekce mutantů, verifikace specificity a stability indukovaných mutací
  
  
• Vývoj protokolů pro regulovatelnou expresi transgenů
  • Příprava transgenních linií s integrovanou kazetou pro regulovanou expresi (Tet-On nebo Tet-Off systém)
  • Příprava a validace transgenních linií s vlastním cílových transgenem s regulovatelnou expresí
  
  
• Následné experimenty s připravenými mutanty
  • Příprava násobných mutantů, komplementační testy atd.
  
  
• Publikování výsledků

Hlavní aktivita 5 Charakterizace neobvyklých funkčních komplexů a drah endosymbiotických organel

V návaznosti na dosavadní výsledky budou detailně studovány vybrané komponenty mitochondrií a plastidů nestandardních modelových systémů, které představují nové a dosud nestudované funkční aspekty těchto organel. Příkladem je např. nově objevený mitochondriální systém na bázi bakteriálního T2SS nebo dosud necharakterizovaná metabolická dráha kódovaná specifickým operonem v plastidovém genomu některých eustigmatofytních řas.

Aktivita bude realizována v dílčích etapách s definovanými cíli, očekávanými pravděpodobnými výstupy, přínosy a poznatky:

• In silico charakterizace organelárních proteomů
  • In silico predikce organelárních proteinů u vybraných taxonů
  • Funkční anotace predikovaných organelárních proteomů
  
  
• Experimentální charakterizace organelárních protemů
  • Optimalizace procedur pro purifikaci organel u vybraných nově definovaných organismálních modelů
  • Identifikace organelárních proteinů pomocí hmotnostní spektrometrie
  • Funkční anotace experimentálně definovaných organelárních proteomů
  
  
• Funkční charakterizace vybraných organelárních komponent
  • In vitro funkční charakterizace cílových proteinů pomocí biochemických a biofyzikálních metod
  • In vivo funkční charakterizace cílových proteinů pomocí metod reverzní genetiky a buněčné biologie
  
  
• Evoluční a fylogenetické analýzy
  • Definování evolučního původu studovaných proteinů pomocí metod molekulární fylogenetiky
  • Komparativně genomické analýzy definující vztah mezi evolucí jednotlivých organismálních skupin, organel a studovaných organelárních komponent
  
  
• Publikování výsledků

Hlavní aktivita 6 Genomická charakterizace nových organismálních linií

Budou získána genomická data z organismů představujících málo studované skupiny mikrobiálních eukaryot, včetně dosud neznámých a nově popisovaných druhů. Výsledky zlepší porozumění fylogenetické diverzitě eukaryot a evoluci jejich genového repertoáru.

Aktivita bude realizována v dílčích etapách s definovanými cíli, očekávanými pravděpodobnými výstupy, přínosy a poznatky:

• Izolace a kultivace nových eukaryotických mikroorganismů
  • Odběr vzorků a etablování laboratorních kultur mikroorganismů
  • Základní fylogenetická charakterizace kultur pomocí standardních molekulárních markerů za účelem výběru organismů zajímavých pro další zkoumání
  
  
• Základní biologická charakterizace nových organismů
  • Cytologické studie pomocí světelné, fluorescenční a elektronové mikroskopie
  • Studium fyziologických projevů (nároky na růstové podmínky, behaviorání projevy, způsoby reprodukce apod.)
  • Formálně taxonomické popisy nových taxonů
  
  
• Generování referenčních genomových dat
  • Produkce hrubých sekvenačních dat pomocí kombinace metod (Illumina a long-read metody)
  • Tvorba referenčních sekvencí genomů a transkriptomů studovaných organismů (assembly a polishing)
  • Strukturní a funkční anotace genomových sekvencí
  
  
• Fylogenomické analýzy
  • Fylogenomické rekonstrukce příbuzenských vztahů studovaných organismálních skupin
  • Definování charakteristických a diagnostických znaků nově studovaných organismů na genomové úrovni
  
  
• Publikování výsledků

Hlavní aktivita 7 Komparativně genomické analýzy nových genů

Bude rekonstruována historie genového repertoáru ve vybraných skupinách eukaryot s cílem porozumět roli genových duplikací, horizontálního přenosu genů a de novo vzniku genů v evoluci těchto skupin. Speciální pozornost bude věnována rekonstrukci metabolických drah a identifikaci kandidátů pro proteiny s novými enzymovými aktivitami, které pak mohou být charakterizovány experimentálními přístupy.

Aktivita bude realizována v dílčích etapách s definovanými cíli, očekávanými pravděpodobnými výstupy, přínosy a poznatky:

• Komparativně genomické analýzy genového repertoáru
  • Rekonstrukce evoluce genového repertoáru studovaných organismálních skupin
  • Podrobnější evoluční analýzy vybraných genů a genových rodin
  
  
• In silico rekonstrukce metabolických a dalších funkčních map
  • Bioinformatické predikce komponent metabolických a dalších funknčních drah a modulů buněk vybraných skupin eukaryotických mikroorganismů
  • Identifikace neobvyklých aspektů těchto drah ("pathway holes", multiplikace paralogů, translační fúze atd.) s cílem vyhledat zajímavé cíle pro experimentální charakterizaci
  
  
• Identifikace nových cílů pro experiemtnální zkoumání pomocí metody fylogenetických profilů
  • Identifikace kandidátů pro nové funkční partnery genů specifického zájmu pomocí metody "phylogenetic profiling"
  • Následné detailní bioinformatické analýzy za účelem validace kandidátů pro experimentální charakterizaci
  
  
• Experimentální charakterizace nově definovaných cílových genů
  • In vitro experimenty a experimenty s použitím heterologních systémů (enzymologické eseje, exprese v E. coli apod.)
  • In vivo experimenty prostřednictvím metod funkční genomiky a buněčné biologie
  
  
• Publikování výsledků

Hlavní aktivita 8 Nové studijní a akademické programy

Bude akreditována nová specializace NMgr. studijního programu a nový program habilitačního a profesorského řízení v oblasti tematicky související s Výzkumným programem "Molekulární biologie a genomika".

Aktivita bude realizována v dílčích etapách s definovanými cíli, očekávanými pravděpodobnými výstupy, přínosy a poznatky

• Akreditace nové specializace NMgr. studijního programu; pracovní název "Genomová biologie a bioinformatika"
  • Příprava akreditačního spisu
  • Podání akreditačního spisu a vypořádání námitek
  
  
• Akreditace nového programu habilitačního a profesorského řízení; pracovní název "Molekulární biologie a genomika"
  • Příprava akreditačního spisu
  • Podání akreditačního spisu a vypořádání námitek
  
  

Spolupráce s dalšími VP

Z důvodu velmi silné mezioborové vazby spolupracuje výzkumný tým VP1 na některých dílčích aktivitách s výzkumnými týmy:

• VP2 v oblasti biofyzikálních a chemických analýz a charakteristik, analytické využití vyvinutých metod – identifikace a kvantifikace vybraných metabolitů, stanovení aktivity enzymů a další analýzy vzorků pro VP1 HA2, 3, 4, 5 a 7
• VP3 pro simulaci a modelování genomových dat, modelování struktur virových proteinů a kapsid (VP1 HA1), modelování struktury a funkce organelárních proteinů (VP1 HA5), modelování struktury a funkce nových proteinů, společná příprava a podání akreditačního spisu, vypořádání námitek – NMgr. studijního programu "Genomová biologie a bioinformatika" (VP1 HA8), spolupráce spočívá zejména ve využití odborného personálu
• VP6 spolupráce na přípravě nového doktorského studijního programu Biomedicína (pracovní název)